薄層色譜TLC的整個操作過程包括以下步驟：
1、薄層板的制備 制薄層板的主要原料是吸附劑和粘結劑
吸附劑：zui常用于 TLC的吸附劑為硅膠 GF254； 硅膠HF254。
粘結劑：一般用所羧甲基纖維素鈉（CMC），也有用淀粉的。CMC 為粉狀固體，用時先加水，水浴上熬成糊狀，配成1％水溶液。
制板：（1）小板的制備：將硅膠加 1％ CMC，調成槳狀（在平鋪玻璃板上能晃動但不能流動），將其涂在載玻片上（ 75 X 25），為使其坦平，可將載玻片用手端平晃動，致坦平為止，放在干凈平坦的臺面上，晾干之后放入110℃烘箱活化1小時即可使用（一次可做很多塊）。
2、點樣 點樣用的毛細管為內徑＜ lmm的管口平整的毛細管，將樣品溶于低沸點的溶劑（乙醚、丙酮、乙醇、四氫呋喃等）配成1％溶液。
點樣前，可先用鉛筆在小板上距一端5mm處輕輕劃一橫線，作為起始線，然后用毛細管吸取樣品在起始線上小心點樣，如需重復點樣，則應待前次點樣的溶劑揮發后方可重點。若在同一塊板上點幾個樣，樣品點間距離為5mm以上。
3、展開 展開劑的選擇主要根據樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因素來考慮。薄層的展開在密閉的容器中進行。先將選擇的展開劑放入色譜器中（小板可用廣口瓶代替），使色譜器內空氣飽和5－10min，再將點好試樣的薄層板放入色譜器中進行展開，點樣的位置必須在展開劑液面之上，當展開劑上升到薄層的前沿（離前端 5－10mm）或多組分已明顯分開時，取出薄層板放平晾干，用鉛筆劃溶劑前沿的位置后，即可顯色。
4、顯色 如果化合物本身有顏色，就可直接觀察它的斑點。如果本身無色，可先在紫外燈光下觀察有無熒光斑點（有苯環的物質都有），用鉛筆在薄層板上劃出斑點的位置；對于在紫外燈光下不顯色的，可放在含少量碘蒸氣的容器中顯色來檢查色點（因為許多化合物都能和碘成黃棕色斑點），顯色后，立即用鉛筆標出斑點的位置。
5、用 TLC跟蹤有機反應 在同一塊板上點上原料樣和反應混合物樣（均需配成稀溶液），按上述方法進行展開和顯色，記下原料樣的斑點位置和反應混合物樣中相應斑點的位置和大小。過一定時間后，再取反應混合物樣液點樣、展開、顯色，如發現反應混合液樣中相應于原料斑點的位置處，無斑點或斑點變小，則說明反應已經完成或接近完成，所以依此可跟蹤有機化學反應。這在有機合成上很有意義。
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